Mécanismes de dérégulation de la polarisation des macrophages et de la résolution de l'inflammation au cours de la cicatrisation de plaies cutanées chez des souris diabétiques de type 2 ; restauration par application topique d'aspirine
- Dardenne, Christophe (2015)
Thèse de doctorat
- Type de document
- Thèse de doctorat
- Diffusion
- Accès libre
- Titre
- Mécanismes de dérégulation de la polarisation des macrophages et de la résolution de l'inflammation au cours de la cicatrisation de plaies cutanées chez des souris diabétiques de type 2 ; restauration par application topique d'aspirine
- Auteur
- Dardenne, Christophe
- Date de soutenance
- 2015-03-16
- École doctorale
- Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
- Structure de recherche
- Pharmacochimie et Biologie pour le Développement (PHARMA-DEV), UMR 152 IRD-UT3
- Discipline
- Physiopathologie
- Sujet
- Sciences du vivant
- Résumé en français
- Le diabète non insulino-dépendant de type 2 demeure un problème majeur de santé publique. Cette pathologie associée au vieillissement, à la sédentarisation et à l'obésité induit un taux élevé de complications. Parmi celles-ci, le défaut de cicatrisation et plus particulièrement le syndrome du " pied diabétique " est une des causes majeures de morbidité et de mortalité chez les patients diabétiques. La compréhension de la dérégulation des mécanismes cellulaires et moléculaires du processus cicatriciel chez le diabétique représente un enjeu essentiel pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. C'est dans ce contexte que ce travail de thèse a été réalisé. La cicatrisation des plaies est un processus physiopathologique complexe, multifactoriel et dynamique visant à rétablir l'intégrité et la fonctionnalité des tissus lésés. Cette réponse biologique nécessite une orchestration et une communication précise entre les cellules inflammatoires infiltrées et les différentes populations cellulaires des tissus. De manière conventionnelle, on distingue 4 principales phases qui peuvent se chevaucher : une première étape d'hémostase généralement couplée à une phase inflammatoire précoce et arrêtée par une phase de résolution de l'inflammation. Une période de prolifération/ régénération permet la génération du nouveau tissu, et enfin, la phase de remodelage tissulaire permet au tissu de retrouver des caractéristiques d'élasticité et de souplesse proche du tissu original. Les données de la littérature suggèrent que le retard de cicatrisation des personnes diabétiques résulterait de la chronicité de la phase inflammatoire. Notre hypothèse de travail a été de démontrer que cette dérégulation était la conséquence d'un défaut majeur de la phase de résolution de l'inflammation. Notre objectif final a été d'agir sur cette phase pour accélérer le processus cicatriciel. La première étape de ce travail de thèse a consisté à mettre en place un modèle de lésions cutanées par excision chez des souris diabétiques de type 2 (en régime hyper lipidique ou déficientes pour le récepteur de la leptine, db/db). Ce modèle expérimental, combiné à la mise au point d'un dispositif médical innovant nous a permis (i) de recueillir stérilement les cellules et l'exsudat produit au niveau de la lésion cutanée, (ii) d'évaluer les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des cellules de l'exsudat et (iii) d'évaluer le taux des médiateurs pro- et anti-inflammatoires au cours du temps. L'ensemble de ce travail a pu être réalisé en préservant l'environnement du tissu cicatriciel. Cette première étape a débouché sur le dépôt de 2 brevets en décembre 2011 (FR 2984719 - FR 2984722) suivi de leur extension Européenne l'année suivante. Cette approche expérimentale nous a permis de démontrer que la dérégulation du processus cicatriciel de souris diabétiques de type II était due, à une forte infiltration au niveau de la lésion de polynucléaires neutrophiles, de macrophages inflammatoires M1 et à un défaut d'afflux de macrophages anti-inflammatoires M2. Tout cela était associé à un défaut d'apoptose des cellules inflammatoires et de leur efférocytose. Ces dérégulations signent un défaut de résolution de l'inflammation que nous avons pu valider par la mise en évidence au niveau de l'exsudat inflammatoire et du tissu cicatriciel d'un excès de leucotriène B4 (LTB4) (métabolite de l'acide arachidonique pro-inflammatoire provenant de la voie de la 5-lipoxygénase) au dépend de la lipoxine A4 (LXA4) (métabolite de l'acide arachidonique anti-inflammatoire produit par les voies des 5-LOX et 12/15-LOX). Ces résultats acquis, nous nous sommes attachés à cibler, par une approche pharmacologique originale, la phase de résolution de l'inflammation pour favoriser la fermeture des plaies des souris diabétiques. Pour cela nous avons choisi d'utiliser une application topique d'acide acétylsalicylique (AAS - aspirine) 3 jours après l'établissement de la lésion cutanée. Nous avons montré que l'AAS accélère la fermeture de la plaie chez les souris diabétiques. La mise en place de ce protocole pharmacologique à permis de réduire de plus de 25% le temps de fermeture de la plaie dans un environnement diabétique fortement délétère pour la cicatrisation. De manière intéressante, nous avons montré que l'AAS oriente le métabolisme de l'acide arachidonique vers la synthèse de LXA4 au dépend du LTB4, favorise le recrutement et la polarisation M2 des macrophages et l'efférocytose des polynucléaires neutrophiles apoptotiques. Parallèlement nous avons montré que le mécanisme d'action de l'AAS implique à la fois l'activité de la 5-LOX et de la 12/15-LOX. En effet, l'AAS perd toute activité sur des souris diabétiques de type 2 en régime hyper-lipidique dont les gènes de la 5-LOX ou de la 12/15-LOX étaient invalidés. De plus nous montrons que le LTA4 (précurseur de la LXA4 ou du LTB4) produit par la 5-LOX permet de restaurer l'absence d'effet de l'AAS chez des souris dont la 5-LOX est invalidée. Finalement, nous avons établi que l'AAS était capable d'induire la synthèse de lipoxines indépendamment de l'expression de COX-2. Ce nouveau mécanisme d'action qui implique l'induction de la 12/15-LOX et l'inhibition de l'expression de la LTA4 hydrolase permet de rétablir une vitesse de la cicatrisation normale des plaies sur ces modèles de souris diabétiques. Un brevet sur l'utilisation de l'acide acétylsalicylique par voie topique pour le traitement des plaies du diabétique a été déposé ; il a été rendu public le 27 juin 2014 (FR 2999936). Son extension Européenne a été engagée. Enfin les résultats obtenus lors de cette étude feront l'objet d'une publication qui sera soumise prochainement.
- Résumé en anglais
- Non-insulin dependent type 2 diabetes is a major public health problem due to its prevalence and the high rate of its degenerative complications. Among these problems, healing disorders and more particularly "diabetic foot" ulcers are one of the leading cause of morbidity and mortality of diabetic patients. The understanding of the deregulation of cellular and molecular mechanisms of the wound healing process in diabetic patients is a key issue for the development of new therapeutic strategies. This work was carried out in this context. Wound healing is a physiological multifactorial and dynamic process aiming to the restoration of the integrity and functionality of injured tissue. This complex biological response requires an orchestration and a precise communication between immuno-inflammatory cells and resident cells in the wound tissue. This process can be divided into four distinct but overlapping phases: an inflammatory phase involving the initial stage of hemostasis arrested by a resolution phase of inflammation; a proliferative/regeneration stage and finally a tissue remodeling phase. Data from the literature suggest that the delayed healing in diabetic patient is principally due to chronic inflammation. Our hypothesis was to demonstrate that deregulation was the result of a major impairment of the resolution phase of inflammation. Our ultimate aim was to influence this phase to accelerate the healing process in diabetic mice. The first step of this study was to develop a new cutaneous excisional wound model in type 2 diabetic mice (in High Fat Diet or leptin receptor deficiency mice db/db). Associated with the development of an innovative device, this model allowed us (i) to treat the wound and follow the wound healing evolution (ii), to collect in aseptically condition and over time the secreted exudate, (ii) to evaluate the phenotypic and functional characteristics of exudate cells and to measure the amount of pro-and anti -inflammatory mediators. This first step leads to the publication of two patent applications (filed in December 2011 and published under the references FR 2984719 and FR 2984722). Our experimental approach demonstrate that the impaired wound healing process in type 2 diabetic mice was due to a strong neutrophil and inflammatory macrophage M1 infiltration, and a lack of influx of anti-inflammatory macrophages M2. All this is associated with a failure in the inflammatory cells apoptosis and efferocytosis. These dysregulations sign a default of resolution of inflammation that we have quantified by the measure of excessive leukotriene (LT) B4, (a proinflammatory arachidonic acid (AA) metabolite from the 5-lipoxygenase pathway) in both exudate and scar tissue, at the expense of the lipoxin (LX) A4 (an anti-inflammatory AA metabolite formed from LTA4 by 12/15-LOX). With an original pharmacological approach, we target the resolution of the inflammatory phase to promote wound closure in diabetic mice. For this we have decided to use topical application of acetylsalicylic acid on the wound (AAS-aspirin), 3 days after the establishment of the skin lesion. We demonstrate that aspirin accelerates wound closure in diabetic mice. This pharmacological protocol reduced by more than 25% the time to close the wound in a highly deleterious diabetic healing environment. Interestingly, we have shown that aspirin orients the arachidonic acid metabolism towards the synthesis of LXA4 at the expense of LTB4, triggers the recruitment of M2-polarized macrophage and promote apoptosis of neutrophils and their efferocytosis. At same time, we have shown that aspirin mechanism involves both the activity of 5- LOX and 12/15-LOX. Indeed, it loses its activity on wound healing in diabetic mice when genes for 5- LOX or 12/15-LOX were invalidated. Moreover we show that LTA4 (precursor of LXA4 or LTB4) produced by 5-LOX can restore the lack of effect of AAS in mice where 5- LOX is invalidated. Finally, we have established that the asprin was able to induce the synthesis of lipoxins regardless of the expression of COX-2. This new mechanism of action which involves the induction of the 12/15-LOX and the inhibition of the expression of the LTA4 hydrolase will restore a normal wound healing kinetic in diabetic mice models via the synthesis of lipid mediators with dual anti-inflammatory and pro-resolution activities. A patent on the topically use of acetylsalicylic acid for the treatment of diabetic wounds has been deposited; it was released in June 2014, under the reference FR2999936. Its European expansion was initiated. Finally, the results obtained in this study will be published and which will be submitted shortly.
- Numéro national de thèse
- 2015TOU30358
- Date de publication
- 2017-01-20T16:45:57
Citation bibliographique
Dardenne, Christophe (2015), Mécanismes de dérégulation de la polarisation des macrophages et de la résolution de l'inflammation au cours de la cicatrisation de plaies cutanées chez des souris diabétiques de type 2 ; restauration par application topique d'aspirine [Thèse de doctorat]