Étude structurale et fonctionnelle des modifications post-traductionnelles du domaine ACP dans les polykétides synthases mycobactériennes de type I

    Nguyen, Minh Chau (2019)
Thèse de doctorat
Accès restreint
    Type de document
    Thèse de doctorat
    Diffusion
    Accès restreint
    Titre
    Étude structurale et fonctionnelle des modifications post-traductionnelles du domaine ACP dans les polykétides synthases mycobactériennes de type I
    Auteur
    Nguyen, Minh Chau
    Directeur de thèse
    Mourey, Lionel
    Pedelacq, Jean-Denis
    Date de soutenance
    2019-03-27
    Établissement de soutenance
    Université de Toulouse
    Université Toulouse III - Paul Sabatier
    École doctorale
    Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
    Structure de recherche
    Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089
    Discipline
    Biologie structurale et fonctionnelle
    Sujet
    Sciences du vivant
    Mots-clés en français
    Mycobacteria
    Polykétide synthase
    4'-phosphopantethéinyl transférase
    ACP
    Résumé en français
    Les mycobactéries pathogènes représentent toujours des menaces majeures pour la santé humaine. Parmi celles-ci, on trouve Mycobacterium tuberculosis, l'agent étiologique de la tuberculose, l'une des maladies les plus dangereuses de l'histoire humaine. D'autre part, Mycobacterium abscessus est de plus en plus redoutée en raison des maladies pulmonaires qu'elle cause, en particulier chez les hôtes vulnérables comme les patients atteints de mucoviscidose. Les polykétides synthases (PKS) participent à la biosynthèse de divers lipides complexes de l'enveloppe cellulaire des mycobactéries, qui constitue la première ligne de défense contre les molécules toxiques de l'hôte. Pour être catalytiquement actives, les PKS doivent être activés post-traductionnellement par les 4'-phosphopantethéinyl transférases (PPTases). Les PPTases transfèrent le bras phosphopantéthéinyl (Ppant) du coenzyme A (CoA) sur un résidu sérine conservé des domaines "acyl carrier protein " (ACP) des PKSs. Une fois activé, ce domaine ACP transfère les produits intermédiaires attachés à l'extrémité du bras Ppant à d'autres domaines catalytiques des PKSs. La caractérisation des interactions entre le domaine ACP et ses partenaires, comprenant les PPTases et les autres domaines d'une même PKSs, est essentielle pour comprendre les relations structure-fonction de cette importante classe de mégasynthases. Dans un premier projet, nous avons choisi de caractériser biochimiquement et structuralement PptAb, la PPTase de M. abscessus, qui est une cible prometteuse pour traiter les patients atteints de mucoviscidose. Nous avons obtenu des cristaux de PptAb dans diverses conditions, à pH acide et physiologique. Nous avons observé un effet du pH sur la liaison des cofacteurs. De plus, nous avons caractérisé l'effet des ions métalliques sur PptAb et constaté que les ions Mn2+ ont un effet positif sur la stabilité de la protéine alors que la réaction de transfert in vitro est plus rapide en présence d'ions Mg2+. Enfin, nous avons déterminé la structure cristallographique du complexe entre PptAb et le domaine ACP de la PKS PpsC de M. tuberculosis, révélant un instantané du transfert du bras Ppant. En outre, les expériences de RMN réalisées sur le domaine ACP ont révélé une certaine flexibilité au niveau des régions engagées dans les interactions avec PptAb. Dans le deuxième projet, nous avons voulu étudier les interactions du domaine ACP de PpsC avec les domaines acyltransférase (AT) et déshydratase (DH) de cette PKS. Afin de piéger les complexes correspondants, nous avons utilisé deux stratégies. La première d'entre elles reposait sur la co-cristallisation des domaines DH et ACP, la sérine conservée de ce dernier étant covalemment liée à des analogues de substrat. En second lieu, nous avons utilisé des agents de pontage fonctionnels pour piéger un complexe stable entre les domaines ACP et AT. Malheureusement, aucune de ces approches méthodologiques n'a été couronnée de succès. En conclusion, cette thèse de doctorat a contribué à la meilleure compréhension des interactions entre le domaine ACP et ses domaines partenaires des PKS. L'information sur l'enzyme PptAb elle-même et son interaction avec le domaine ACP devrait être un élément important pour la conception rationnelle de médicaments et, par conséquent, pour le développement d'alternatives thérapeutiques pour traiter les patients atteints de mucoviscidose. Nos tentatives de piégeage de complexes ACP-AT et ACP-DH devraient permettre d'élaborer de nouvelles stratégies d'étude de la reconnaissance entre l'ACP et ses domaines partenaires.
    Résumé en anglais
    Pathogenic mycobacteria continue to pose major threats for human health. Among them is Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of tuberculosis, one of the most dangerous diseases in human history. On the other hand, Mycobacterium abscessus is gaining attention as it causes pulmonary diseases, especially in vulnerable hosts such as patients with cystic fibrosis. Polyketide synthases (PKSs) participate in the biosynthesis of various complex lipids of the mycobacterial cell envelope, which constitutes the first line of defense against toxic molecules from the host. To be catalytically active, PKSs must be activated post-translationally by 4'-phosphopantetheinyl transferases (PPTases). PPTases transfer the 4'-phosphopantetheinyl (Ppant) arm of coenzyme A (CoA) to the conserved serine residue of acyl carrier protein (ACP) domains of PKSs. Once activated, the ACP domain brings intermediate products tethered to the extremity of the Ppant to other catalytic domains of PKSs. Interactions between ACP domain with its partners, including PPTases and other PKS domains, is central to understand structure-function relationships of this important class of megasynthases. In a first project, we chose to characterize biochemically and structurally PptAb, the PPTase from M. abscessus, which is a promising drug target to treat patients with cystic fibrosis. We have obtained crystals of PptAb in various pH conditions, from acidic to physiological. We observed an effect of the pH on cofactors binding. Besides, we characterized the effect of metal ions on PptAb and found that Mn2+ have a positive effect on stability of the protein whereas the in vitro transfer reaction completes quicker in the presence of Mg2+. In addition, we have determined the crystal structure of PptAb in complex with the ACP domain of the PKS PpsC from M. tuberculosis, revealing a snapshot of the Ppant transfer intermediate. NMR experiments performed on ACP domain revealed flexibility on regions that participate in interactions with PptAb. In a second project, we attempted to study interactions of ACP with the acyltransferase (AT) and dehydratase (DH) domains from PpsC. In order to trap the domains together, we employed two strategies. The first one was to co-crystallize the DH and ACP domains of PpsC with substrate analogues tethered to the conserved serine residue of ACP. In the second place, we used function-based crosslinkers to artificially maintain ACP and AT together. Unfortunately, none of these attempts was successful. To conclude, this PhD thesis has contributed to the better understanding of the interactions between the ACP domain and its PKS partners. Information on PptAb itself and its interaction with ACP domain should be beneficial for rational drug design and in turn the development of therapeutic alternatives to treat patients with cystic fibrosis. Our attempts on trapping ACP with AT and DH should help elaborating strategies for studying ACP-partner domain recognition.
    Numéro national de thèse
    2019TOU30045
    Date de publication
    2020-01-15T13:51:47

Citation bibliographique

Nguyen, Minh Chau (2019), Étude structurale et fonctionnelle des modifications post-traductionnelles du domaine ACP dans les polykétides synthases mycobactériennes de type I [Thèse de doctorat]