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Thèse de doctorat

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Titre

Dynamique structurale de complexes RCPG - neuropeptides

Auteur

Ferré, Guillaume

Directeur de thèse

Milon, Alain

Demange, Pascal

Date de soutenance

2019-09-27

Établissement de soutenance

Université de Toulouse

Université Toulouse III - Paul Sabatier

École doctorale

Biologie, santé, biotechnologies (BSB)

Structure de recherche

Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089

Discipline

Biologie structurale et fonctionnelle

Sujet

Sciences du vivant

Mots-clés en français

Neuropeptides

Dynamique fonctionnelle

Membranes

Transduction du signal

Résumé en français

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) reconnaissent un ligand extracellulaire afin de transmettre l'information correspondante à l'intérieur de la cellule. Ils sont des acteurs prépondérants en physiologie ainsi que des cibles pharmacologiques majeures. Nous avons étudié deux RCPG dont les ligands endogènes sont des peptides. a) Le récepteur ĸ opioïde (KOP) qui reconnait la dynorphine. Ce récepteur joue un rôle fondamental dans la régulation de la douleur et des mécanismes de récompense (et donc dans l'addiction). La découverte, la pharmacologie et les relations structure - fonction de la dynorphine sont décrites dans cette thèse sous la forme d'une revue publiée en 2019 dans "Vitamins and Hormones". L'activité des RCPG est assurée par une dynamique conformationelle riche et la résonance magnétique nucléaire (RMN) est particulièrement adaptée pour l'étudier. Elle nécessite néanmoins le marquage isotopique de la protéine d'intérêt, or la plupart des études structurales utilisent des RCPG surexprimés en cellules d'insecte. Nous avons mis au point la production de KOP avec une stratégie d'expression chez E. coli, outil de choix pour le marquage isotopique. Le récepteur recombinant a été purifié puis renaturé en micelles de détergent et s'est avéré être fonctionnel pour la liaison de son ligand. Ce sera un outil de choix pour des études structurales et dynamiques par RMN. b) Le récepteur sécrétagogue de l'hormone de croissance (GHSR), qui est naturellement activé par la ghréline, une hormone peptidique digestive acylée impliquée dans l'appétit, la sécrétion de l'hormone de croissance et l'homéostasie du glucose. Les interactions peptide - RCPG sont mal connues au niveau structural en raison de la difficulté à cristalliser ces complexes. Utilisant un récepteur GHSR perdeutérié, produit dans E. coli et reconstitué en nanodisques lipidiques dans l'équipe de J.L. Banères (IBMM, Montpellier), nous avons utilisé différentes expériences de RMN (relaxation 15N, NOE transféré et STD) pour caractériser finement la structure et la dynamique de la ghréline liée à son récepteur. Nous avons ainsi mis en évidence le mécanisme par lequel la chaîne acyle en position 3 de la ghréline assure une reconnaissance spécifique par GHSR.

Résumé en anglais

G protein-coupled receptors (GPCR) recognize an extracellular ligand in order to transmit the corresponding information inside the cell. They are major players in physiology and predominant pharmacological targets. Here, we studied two GPCR for which the endogenous ligands are peptides. a) The ĸ opioid receptor (KOP), which recognizes dynorphin, and which is involved in the regulation of pain and reward mechanism (and thus in addiction). The discovery, pharmacology and structure - activity relationship of dynorphin are described in this manuscript as a review published in "Vitamins and Hormones" in 2019. GPCR activity requires a complex conformational dynamics and nuclear magnetic resonance (NMR) is an excellent technique allowing such characterization. However, it requires isotope labeling of the proteins of interest and most of GPCR structural studies used receptors expressed in insect cells. We produced KOP using an E. coli expression strategy, which is the tool of choice for isotope labeling. The recombinant receptor was successfully refolded in detergent micelles and was shown to be functional in terms of ligand binding. It offers new possibilities to study its structure and dynamics by NMR. b) The growth hormone secretagogue receptor (GHSR) is naturally activated by ghrelin, a digestive peptide hormone of 28 amino-acids residues. This hormone - receptor system is involved in a multitude of physiological process such as the regulation of food intake, growth hormone secretion and glucose homeostasis. However, structural information about peptide - GPCR interaction is sparse because of the difficulty in crystallizing such complexes. Using a perdeuterated receptor expressed in E. coli and refolded in lipid nanodiscs in the group of J.L. Banères (IBMM, Montpellier), we used several liquid state NMR techniques (15N relaxation, transferred NOE, saturation transfer difference) to characterize the 3D structure and dynamics of ghrelin bound to GHSR. Our work particularly shed the light on the role of a post-translational modification (acylation on Ser 3) on the receptor specific recognition mechanism.

Numéro national de thèse

2019TOU30141

Date de publication

2020-02-13T09:34:06