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Thèse de doctorat

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Accès restreint

Titre

Recherche et caractérisation des enzymes-clés du processing des lipides mycobactériens

Auteur

Tomas, Nicolas

Directeur de thèse

Lemassu, Anne

Marrakchi, Hedia

Date de soutenance

2020-01-21

Établissement de soutenance

Université de Toulouse

Université Toulouse III - Paul Sabatier

École doctorale

Biologie, santé, biotechnologies (BSB)

Structure de recherche

Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089

Discipline

Biologie structurale et fonctionnelle

Sujet

Sciences du vivant

Mots-clés en français

Mycobactéries

Biochimie

Biotechnologie

Lipides

Baeyer-Villiger monooxygénase

Résumé en français

La tuberculose causée par Mycobacterium tuberculosis (Mtu), est un problème de santé majeur aggravé par la résurgence inquiétante de souches de Mtu multirésistantes aux antibiotiques. Il est crucial de développer de nouvelles molécules antituberculeuses et de découvrir des cibles thérapeutiques. L'enveloppe de Mtu, atypique et très peu perméable, contient des acides mycoliques, acides gras à très longues chaines, qui sont essentiels et dont le métabolisme représente un réservoir de cibles validées. La dégradation de ces molécules, qui semble importante lors des mécanismes de l'infection de l'hôte, reste encore peu explorée.Le projet de thèse a porté sur l'étude de la première étape-clef de cette voie, catalysée par une enzyme de la famille des Baeyer-Villiger-Mono-Oxygénase (BVMO). Cette étape d'oxygénation permet d'adresser l'acide mycolique vers la voie de dégradation. Nous avons sélectionné cinq candidats potentiels pour cette étape sur le génome de Mtu, dont trois codant des protéines "BVMO-like", présentant une séquence signature BVMO. L'expression et l'optimisation de la production des différentes protéines candidates dans deux systèmes d'expression, Escherichia coli et Mycobacterium smegmatis, ont été réalisées. L'activité BVMO et les spécificités de substrat des protéines candidates ont été testées. Les candidats BVMO-like ont une plus forte activité en présence d'un substrat aliphatique présentant un pseudo-motif mycolique par rapport à d'autres substrats cyclique ou aliphatiques testés. Ces résultats sont en accord avec l'hypothèse que ces candidats BVMO-like pourraient être impliqués dans la première étape de dégradation des acides mycoliques. Deux des trois BVMO sont déjà connues pour activer la prodrogue éthionamide, un antituberculeux de seconde ligne. Ces travaux montrent également que la troisième BVMO peut elle aussi métaboliser ce composé.Dans le but d'approfondir les connaissances sur le rôle de ces protéines candidates chez Mtu, deux stratégies complémentaires ont été adoptées, la production et l'analyse de (i)souches de surexpression et (ii) mutants de délétion. L'analyse lipidomique des souches de surexpression montre des variations quantitatives significatives des glycolipides contenant des acides mycoliques, le monomycolate de tréhalose et le dimycolate de tréhalose. D'autre part, les différents mutants de délétion présentent des variations quantitatives d'un composé apolaire potentiellement apparenté à un produit de la voie de dégradation des acides mycoliques. L'ensemble des travaux de lipidomique semble confirmer le lien entre les BVMO et le métabolisme des acides mycoliques, et notamment leur dégradation.

Résumé en anglais

Tuberculosis caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtu) is a major health problem aggravated by the worrying resurgence of multi-resistant Mtu strains. It is crucial to develop new anti-tuberculosis molecules and discover therapeutic targets. The Mtu envelope, atypical and displaying very low permeability, contains mycolic acids, very long chain fatty acids, which are essential and whose metabolism represents a reservoir of validated targets. The degradation of these molecules, which seems important during the mechanisms of host infection, has yet to be fully explored.The thesis project focused on the study of the first key step of this pathway, catalyzed by an enzyme from the Baeyer-Villiger-Mono-Oxygenase (BVMO) family. This oxygenation step allows the mycolic acid to be directed towards the degradation pathway. We have selected five potential candidates for this step on the Mtu genome, including three coding for BVMO-like proteins with a BVMO signature sequence. The expression and optimization of the production of the various candidate proteins in two expression systems, Escherichia coli and Mycobacterium smegmatis, were carried out. The BVMO activity and substrate specificities of the candidate proteins were tested. BVMO-like candidates have a higher activity in the presence of an aliphatic substrate with a mycolic pseudo-motif compared to other cyclic or aliphatic substrates tested. These results are in agreement with the hypothesis that these BVMO-like candidates could be involved in the first step of mycolic acid degradation. Two of the three BVMOs are already known to activate the prodrug ethionamide, a second-line anti-tuberculosis drug. This work also shows that the third BVMO can also metabolize this compound. To further our knowledge of the role of these candidate proteins in Mtu, two complementary strategies were adopted, the production and analysis of (i) overexpression strains and (ii) deletion mutants. Lipidomic analysis of overexpression strains shows significant quantitative variations in glycolipids containing mycolic acids, trehalose monomycolate and trehalose dimycolate. On the other hand, the different deletion mutants exhibit quantitative variations of an apolar compound potentially related to a product of the mycolic acid degradation pathway. All the lipidomic studies seem to confirm the link between BVMOs and the metabolism of mycolic acids, and in particular their degradation.

Numéro national de thèse

2020TOU30072

Date de publication

2020-11-20T08:46:17