Etude des mécanismes de présentation des lipides mycobactériens par les protéines CD1

    Carrat, Christophe (2019)
Thèse de doctorat
Accès restreint
    Type de document
    Thèse de doctorat
    Diffusion
    Accès restreint
    Titre
    Etude des mécanismes de présentation des lipides mycobactériens par les protéines CD1
    Auteur
    Carrat, Christophe
    Directeur de thèse
    Gilleron, Martine
    Date de soutenance
    2019-07-16
    Établissement de soutenance
    Université de Toulouse
    Université Toulouse III - Paul Sabatier
    École doctorale
    Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
    Structure de recherche
    Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089
    Discipline
    Biologie structurale et fonctionnelle
    Sujet
    Sciences du vivant
    Mots-clés en français
    Tuberculose
    Protéine CD1
    Lipide
    Antigène
    Vaccin
    Résumé en français
    Les antigènes lipidiques sont présentés aux lymphocytes T par les protéines CD1 (CD1a à CD1d), exprimées à la surface des cellules présentatrices d'antigènes (CPA), telles que les cellules dendritiques. Dans le cadre de la tuberculose, dont l'agent étiologique est Mycobacterium tuberculosis (Mtb), un certain nombre d'antigènes lipidiques ont été décrits depuis une vingtaine d'années et sont, pour la plupart, présentés par l'isoforme CD1b. Plus récemment, il a été montré que ces antigènes peuvent être apprêtés par des enzymes lysosomales de la CPA, à l'instar de ce qui est connu pour la présentation de peptides par le complexe majeur d'histocompatibilité. L'apprêtement des antigènes lipidiques fait intervenir des protéines de transfert de lipides, telle que la protéine CD1e, une cinquième isoforme soluble nécessaire à la présentation des phosphatidyl-myo-inositol mannosides (PIM). Cependant, les mécanismes de l'apprêtement des antigènes lipidiques ainsi que les épitopes réellement présentés par CD1b à la surface des CPA sont à l'heure actuelle encore mal connus. Afin d'identifier les épitopes lipidiques présentés par CD1b lors d'une infection par Mtb, nous avons développé une stratégie innovante permettant d'isoler les complexes CD1b: lipides présents en surface des CPA, en s'affranchissant de l'utilisation de détergents, proscrits ici. Cette stratégie repose sur la construction d'une CPA comportant une forme clivable de la protéine CD1b, exprimant CD1e ou non. Les conditions de clivage et de purification de ces complexes ont été mises au point au cours de ce travail. Les lipides sont ensuite extraits et analysés par HPLC couplée à la spectrométrie de masse. Cette approche a permis l'analyse des lipides endogènes présents dans CD1b. Elle a ensuite été validée par des expériences de stimulation des CPA par des lipides mycobactériens purifiés. Afin d'améliorer la détection des épitopes par spectrométrie de masse, des optimisations des conditions de stimulation des CPA sont actuellement en cours. Le second axe développé au cours de ma thèse a porté sur l'étude des enzymes impliquées dans l'apprêtement des antigènes lipidiques. Les glycolipides mycobactériens peuvent être le substrat d'enzymes lysosomales. Les PIM en sont l'exemple le mieux caractérisé, car des enzymes intervenant dans l'hydrolyse de la partie saccharidique et de la partie hydrophobe du lipide ont été identifiées. Pour déterminer de nouvelles activités enzymatiques impliquées dans l'apprêtement des glycolipides de Mtb, nous avons cherché à générer une fraction lysosomale issue de CPA pour réaliser des tests de dégradation in vitro. Ces tests de dégradation de PIM2 tétra-acylés ont révélé la présence de formes dégradées correspondant principalement à des PIM2 di et tri-acylés, générés par l'action de lipases dont certaines ont déjà été caractérisées dans la littérature. L'analyse protéomique du contenu de la fraction lysosomale devrait conduire à la particularisation de nouveaux acteurs de l'apprêtement. Les sulfoglycolipides (SGL) di-acylés sont des lipides spécifiques de l'enveloppe de Mtb et ont été décrits comme des antigènes immunogènes pouvant activer des LT CD8+ aux propriétés bactéricides. Les SGL sont actuellement considérés comme des candidats à inclure dans un vaccin sous-unitaire contre la tuberculose. Afin de voir si ce glycolipide est synthétisé par toutes les lignées de Mtb retrouvées à travers le monde ou seulement par certaines d'entre elles, des analyses de lipidomique de différentes souches d'isolats cliniques ont été réalisées. Les résultats montrent que ces glycolipides, en particulier les formes diacylées, sont produits par toutes les souches étudiées. L'analyse de ces molécules a également révélé dans les isolats cliniques des glycolipides de plus haut poids moléculaire que pour ceux de la souche de laboratoire H37Rv.
    Résumé en anglais
    Lipid antigens are presented to T cells by CD1 proteins (CD1a to CD1d), expressed at the surface of antigen presenting cells (APC), such as dendritic cells. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is the etiological agent of tuberculosis (TB). Mtb lipid antigens have been described over the last twenty years and are, most of them being presented by the CD1b isoform. Recent studies in humans have shown that specific T cell responses to Mtb lipid antigens play a role in the immune response to infection, and contribute to the creation of a reservoir of memory cells. More recently, it has been shown that these antigens can be processed by lysosomal enzymes in APC, similarly to that described for the presentation of peptides by the major histocompatibility complex. Lipid antigens processing involves lipid transfer proteins, such as CD1e, a fifth soluble isoform of CD1 necessary for the presentation of phosphatidyl-myo-inositol mannosides (PIM). However, the mechanisms of lipid antigen processing as well as the repertoire of epitopes presented by CD1b at the surface of APC are still poorly understood. In order to identify the lipid epitopes presented by CD1b during Mtb infection, we developed an innovative strategy to isolate the CD1b:lipid complexes at the surface of APC, by avoiding the use of detergents. This strategy is based on the construction of APC cell lines. Different APC were constructed, that may or may not express CD1e. The conditions of CD1b cleavage and purification, as well as the extraction of the lipids and their analysis by mass spectrometry were set up and optimized. The lipids are then extracted and analyzed by HPLC coupled to mass spectrometry. In a first step, this approach was used to study the endogenous lipids presented by CD1b. It was then validated by APC stimulation experiments with purified mycobacterial lipids. Detecting Mtb epitopes during infection requires a high sensitivity in mass spectrometry. Therefore, optimizations of the APC stimulation efficiency are in progress. The second axis developed during my PhD focused on the study of enzymes involved in lipid antigen processing. Mycobacterial glycolipids may be the substrates of lysosomal enzymes. Among them, the PIM family is the best characterized example, with enzymes involved in the hydrolysis of both the saccharide and the lipid part. To characterize new enzymatic activities involved in processing of Mtb glycolipids, we sought to generate a lysosomal fraction from APC to perform in vitro digestion tests. Digestion tests for tetra-acylated PIM2 yielded di and tri-acylated PIM2 generated by lipase activities. Some of the activities can be assigned to lipases already described in the literature, others arise from lipases that remain to be characterized. Protein candidates involved in lipid processing will be identified by proteomic analysis of the lysosomal fraction. Di-acylated sulfoglycolipids (SGL) are lipids specific for the Mtb envelope and have been described as immunogenic antigens capable of activating CD8+ T cells with bactericidal properties. These glycolipids are thus proposed as new antigen to be included in a subunit vaccine against TB. In order to determine whether this glycolipid is synthesized by all Mtb lineages or only by some of them, a lipidomic analysis of different Mtb clinical isolates was performed. We found that SGL, in particular the di-acylated forms, are produced by all the strains studied, covering all the lineages. Moreover, SGL of the clinical isolates usually contain fatty acids with higher molecular weight.
    Numéro national de thèse
    2019TOU30293
    Date de publication
    2020-12-02T12:35:01

Citation bibliographique

Carrat, Christophe (2019), Etude des mécanismes de présentation des lipides mycobactériens par les protéines CD1 [Thèse de doctorat]