Hétérogénéité ribosomique et régulation de la traduction des ARNm des facteurs de croissance (lymph)angiogéniques dans les cardiomyocytes stressés

    David, Florian (2022)
Thèse de doctorat
    Type de document
    Thèse de doctorat
    Diffusion
    Accès libre
    Titre
    Hétérogénéité ribosomique et régulation de la traduction des ARNm des facteurs de croissance (lymph)angiogéniques dans les cardiomyocytes stressés
    Auteur
    David, Florian
    Directeur de thèse
    Prats, Anne-Catherine
    Date de soutenance
    2022-02-28
    Établissement de soutenance
    Université de Toulouse
    Université Toulouse III - Paul Sabatier
    École doctorale
    Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
    Structure de recherche
    Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (I2MC), INSERM UMR 1048
    Discipline
    Biologie Structurale et Fonctionnelle
    Sujet
    Sciences du vivant
    Mots-clés en français
    Cardiomyocytes
    Stress
    Traduction
    IRES
    ITAF
    Hétérogénéité ribosomique
    Résumé en français
    L'ischémie cardiaque, définie comme la baisse de perfusion sanguine d'une partie du cœur, soumet les cellules à différents stress induits par la baisse de l'apport en oxygène et nutriments. S'ils perdurent, ces stress induisent la mort cellulaire et par la suite un infarctus du myocarde. Afin de rétablir l'homéostasie tissulaire et de revasculariser le tissu ischémique, les cellules activent différents mécanismes tels que l'angiogenèse et la lymphangiogenèse. Mon projet de thèse a porté sur l'étude de ces voies et leur régulation au niveau traductionnel dans des cardiomyocytes soumis à différents stress. L'analyse semi-globale du transcriptome et du traductome en condition hypoxique nous a montré que, dans les cardiomyocytes, les gènes (lymph)angiogéniques sont majoritairement régulés au niveau traductionnel. Parmi ces gènes, ceux possédant des structures IRES (Internal Ribosome Entry Site) sont recrutés de manière plus efficace dans les polysomes. Or, la régulation de la traduction via ces structures représente un mécanisme-clé dans la réponse à l'hypoxie. Nous avons identifié une protéine, la vasohibine 1, liée à l'ARN et présentant lors de l'hypoxie une fonction d'ITAF (IRES Trans-Acting Factor). Dans un deuxième volet de cette thèse, nous avons caractérisé le rôle d'un long ARN non codant, Neat1, dans la régulation de la traduction IRES dépendante en réponse à l'hypoxie. Neat1 est le composant principal d'un corps nucléaire, le paraspeckle, qui se forme en réponse au stress. Le paraspeckle est formé de Neat1 et de plusieurs protéines qui interagissent avec ce long ARNnc, dont certaines présentent aussi une fonction d'ITAF, suggérant un rôle du paraspeckle dans le contrôle de la traduction. Ainsi nous avons identifié par des expériences de déplétion que Neat1, plus particulièrement sa grande isoforme Neat1-2, possède un rôle d'ITAF qui régule tous les IRES des facteurs (lymph)angiogéniques. D'autres composants du paraspeckle, p54nrb et pSPC1, régulent différents sous-groupes d'ARNm à IRES. L'analyse de l'intéractome de p54nrb a permis d'identifier de nouveaux partenaires nucléaires et cytoplasmiques de cette protéine, spécifiques de l'hypoxie, dont la protéine ribosomique uS5 (RPS2) et la nucléoline, qui présentent elles aussi une fonction d'ITAF. Ces résultats suggèrent que le paraspeckle pourrait être une plateforme d'assemblage de l'IRESome, complexe responsable de la traduction IRES-dépendante, dont Neat1 est un acteur majeur. Le troisième volet de ma thèse porte sur l'identification de ribosomes spécialisés responsables de la traduction IRES-dépendante lors du stress. L'analyse de la composition des polysomes de cardiomyocytes humains soumis à un stress du RE nous a permis de découvrir plusieurs protéines ribosomiques mitochondriales associées aux polysomes. Pour certaines d'entre elles cette association augmente significativement (MRPS15, MRPS12) alors que pour d'autres elle diminue lors du stress (MRPS35, MRPL52), appuyant le concept de ribosomes spécialisés. Nous avons par la suite confirmé l'interaction de MRPS15 avec le ribosome en réalisant des expériences de PLA (proximity ligation assay) et d'immunoprécipitations. De plus MRPS15 comporte une fraction cytoplasmique qui augmente en réponse au stress. Cette localisation cytoplasmique s'accompagne d'un rôle dans le contrôle traductionnel : des expériences de déplétion et de surexpression démontrent que MRPS15 est impliquée dans l'activation de la traduction IRES-dépendante. Enfin l'analyse par RNAseq du traductome permet de montrer que les ribosomes composés de MRPS15 régulent la traduction d'un ensemble d'ARNm à IRES ainsi que ceux codant les effecteurs de la réponse UPR. Ces résultats mettent en lumière un rôle nouveau des protéines ribosomiques mitochondriales dans la formation de ribosomes spécialisés de la réponse au stress du RE dans les cardiomyocytes.
    Résumé en anglais
    Cardiac ischemia, defined as a blood perfusion diminution in a part of the heart, subjects cells to various stresses caused by oxygen and nutrient supply diminution. If they persist, these stresses induce cell death and subsequently myocardial infarction. In order to restore tissue homeostasis as well as the vascularization of ischemic tissue, cells activate various mechanisms such as angiogenesis and lymphangiogenesis. My thesis project focused on the study of these pathways and their regulation at the translational level in cardiomyocytes subjected to different stresses. The semi-global analysis of the transcriptome and the translatome in hypoxic condition showed us that angiogenic and lymphangiogenic genes are not drastically regulated at the transcriptional level while the majority of them are induced at the translational level in murine cardiomyocytes. Among these genes, those having IRES (Internal Ribosome Entry Site) structures are recruited more efficiently into polysomes. Regulation of translation through the presence of these structures is a key mechanism in the response to hypoxia. We have identified a protein, vasohibin 1, bound to FGF1 IRES and presenting during hypoxia an ITAF (IRES Trans-Acting Factor) function. In a second part of this thesis work, we characterized the key role of a long non-coding RNA, Neat1, in the regulation of IRES-dependent translation in response to hypoxia. Neat1 is the main component of a nuclear body, the paraspeckle, which forms in response to stress. The paraspeckle is made up of Neat1 and several proteins, that interact with this long ncRNA, and are also known to exhibit ITAF function, hence the hypothesis of a role of the paraspeckle in the control of translation. Thus we have identified by depletion experiments, that Neat1, more particularly the long isoform of this ncRNA, Neat1-2, has a role of ITAF promoting the IRES-dependent translation of angiogenic and lymphangiogenic factors. Other components of the paraspeckle, p54nrb and pSPC1, regulate different subgroups of IRESs. The analysis of the interactome of p54nrb by mass spectrometry allowed to identify new nuclear and cytoplasmic partner specific of hypoxia, among them the ribosomal protein uS5 (RPS2) and nucleolin, which both present an ITAF function. These results suggest that the paraspeckle could be an assembly platform for IRESome, a complex responsible for IRES-dependent translation, and that Neat1 is a key regulator of this mechanism. The third part of my thesis concerns the identification of specialized ribosomes involved in IRES-dependent translation during stress. Analysis of the composition of polysomes of human cardiomyocytes under endoplasmic reticulum (ER) stress allowed us to discover several mitochondrial ribosomal proteins associated with the polysomes. Cellular stresses induced a switch in polysome composition, inducing an increase of the association with some mitochondrial ribosomal proteins (MRPS12 and MRPS15) while others were decreased (MRPS35 and MRPL52). The rest of the study focused on MRPS15. First, experiments with PLA (proximity ligation assay) and immunoprecipitations from cytosolic and polysomal fractions confirmed the interaction of this mitochondrial protein with the ribosome. In addition, a cytoplasmic fraction of MRPS15 increases in response to stress. This cytoplasmic localization allowed a role in translational control : depletion and overexpression experiments demonstrate that MRPS15 behaves as an activator of IRES-dependent translation. Finally, polysome immunoprecipitation profiling experiment showed translationnal regulation of a subset of IRESs mRNA and mRNA coding UPR response proteins by specialized ribosomes composed of MRPS15. These results highlight a novel role for mitochondrial ribosomal proteins in the translationnal regulation in stressed cardiomyocytes.
    Numéro national de thèse
    2022TOU30054
    Date de publication
    2022-06-22T12:27:37

Citation bibliographique

David, Florian (2022), Hétérogénéité ribosomique et régulation de la traduction des ARNm des facteurs de croissance (lymph)angiogéniques dans les cardiomyocytes stressés [Thèse de doctorat]