Les trois domaines désordonnés de la protéine Knr4 et leur rôle dans l'hypersensibilité au stress et les interactions protéine-protéine chez la levure Saccharomyces cerevisiae

    Donker, Helena Ignatia Maria (2024)
Thèse de doctorat
    Type de document
    Thèse de doctorat
    Diffusion
    Accès libre
    Titre
    Les trois domaines désordonnés de la protéine Knr4 et leur rôle dans l'hypersensibilité au stress et les interactions protéine-protéine chez la levure Saccharomyces cerevisiae
    Auteur
    Donker, Helena Ignatia Maria
    Directeur de thèse
    Maveyraud, Laurent
    Zerbib, Didier
    Date de soutenance
    2024-01-26
    Établissement de soutenance
    Université de Toulouse
    Université Toulouse III - Paul Sabatier
    École doctorale
    Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
    Structure de recherche
    Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089
    Discipline
    Biologie structurale et fonctionnelle
    Sujet
    Sciences du vivant
    Mots-clés en français
    Knr4/Smi1
    Protéine intrinsèquement désordonnée
    Saccharomyces cerevisiae
    Intégrité de la paroi cellulaire
    Biologie structurale et moléculaire
    Interactions protéine-protéine
    Résumé en français
    La suppression de la protéine Knr4/Smi1, spécifique du règne fongique, rend Saccharomyces cerevisiae et Candida albicans hypersensibles aux antifongiques et aux stress pariétaux. Plusieurs voies de signalisation sont cruciales pour répondre à ces stress. Chez S. cerevisiae, la protéine "hub" Knr4 est au carrefour de ces voies. Cette thèse explore le rôle de Knr4 dans la réponse au stress et la résistance aux antifongiques. Knr4 interagit génétiquement et physiquement avec de nombreuses protéines, y compris celles des voies de l'intégrité de la paroi cellulaire (IPC) et de la calcineurine. Les études de la structure de Knr4, réalisées par diffusion des rayons X aux petits angles et cristallographie, révèlent qu'elle est constituée d'un domaine central structuré interrompu par une boucle désordonnée et flanqué de domaines N- et C-terminaux désordonnés. D'autres études sur des protéines intrinsèquement désordonnées (PID), comme le suppresseur de tumeur p53, suggèrent que les domaines désordonnés jouent un rôle essentiel dans leur fonction. A l'aide de CRISPR/Cas9, des mutants chromosomiques de Knr4 ont été créés en supprimant un ou plusieurs domaines désordonnés. Des essais de croissance en milieu liquide et solide ont révélé que le domaine N-terminal et la boucle sont essentiels pour la résistance aux agents de liaison de la paroi cellulaire (rouge Congo et blanc de calcofluor), à la caspofungine, à la chaleur, à l'acide sorbique, au LiCl, à l'éthanol, et à la caféine. La suppression du domaine C-terminal augmente la résistance aux facteurs de liaison à la paroi mais n'affecte pas la résistance aux autres facteurs de stress testés. Les effets positifs de l'extrémité N-terminale et négatifs de l'extrémité C-terminale se manifestent dans l'interaction de Knr4 avec l'une de ses protéines partenaires, Slt2, la MAPK de la voie IPC. Ces résultats suggèrent que les domaines désordonnés de Knr4 jouent un rôle crucial dans son interaction avec des protéines partenaires comme Slt2, pour sa fonction dans la résistance au stress. Des expériences de titration par RMN avec la protéine partenaire Tys1 indiquent une faible affinité de liaison entre Knr4 et Tys1, en mettant en évidence des régions d'interaction dans le domaine N-terminal et la boucle de Knr4. Ces régions pourraient jouer un rôle dans l'interaction de Knr4 avec Slt2 et éventuellement avec d'autres de ses protéines partenaires. Lors de l'induction de la voie IPC, Slt2 est phosphorylée et pénètre dans le noyau pour activer la transcription de gènes cibles. Nous avons montré que la suppression simultanée du domaine N-terminal et de la boucle augmente les niveaux d'expression de Slt2 et sa phosphorylation. Cela est également observé pour la souche knr4Δ ce qui suggère un rôle inhibiteur de Knr4 sur la présence de Slt2 phosphorylée, un indicateur de l'activation de la voie IPC. Cette thèse a permis d'identifier les domaines désordonnés de la protéine "hub" Knr4 comme étant des modulateurs de la fonction de protection contre de multiples stress et des interactions avec l'une de ses protéines partenaires clés, la MAPK Slt2. Certains des facteurs de stress induisent une augmentation de la phosphorylation de Slt2 et donc de la signalisation IPC. Ce phénotype se retrouve dans les mutants exempts de l'extrémité N-terminale et de la boucle de Knr4. Par conséquent, nous proposons que la PID Knr4 agirait (directement ou indirectement) dans l'inhibition de la voie IPC, les domaines désordonnés de la protéine jouant un rôle essentiel. Ces derniers, en raison de la nature de hub de Knr4, pourraient également jouer un rôle dans la régulation des interactions avec d'autres protéines partenaires et être impliqués dans les différentes fonctions de la protéine.
    Résumé en anglais
    Knr4/Smi1 is a fungus-specific protein and its deletion makes Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans hypersensitive to specific antifungals and cell wall stresses. Signalling pathways play an essential role in the response to cellular stress. In S. cerevisiae, the Knr4 hub protein is located at the crossroads of several signalling pathways. This thesis focuses on its crucial role in stress response and resistance to antifungal agents. Knr4 interacts genetically and physically with numerous proteins, including proteins of the Cell Wall Integrity (CWI) and Calcineurin pathways. Small-angle X-ray scattering and crystallographic analysis showed that Knr4 is composed of a structured core domain interrupted by a small disordered loop and flanked by large disordered N- and C-termini. Given the results obtained on other intrinsically disordered proteins (IDPs), such as the tumour suppressor p53, it was hypothesised that the disordered domains of Knr4 are functionally significant. Chromosomal mutants of Knr4 were constructed using the CRISPR/Cas9 technique, in which one or multiple of the disordered domains of Knr4 were deleted. Cell resistance to different types of stress factors was assessed by growth assays in liquid and solid media. Results revealed that the N-terminal domain and loop are essential for optimal resistance to cell wall binding agents Congo red and Calcofluor white, the antifungal Caspofungin, high temperature or chemicals such as sorbic acid (acid stress), LiCl (ionic stress), ethanol or the purine analogue Caffeine. Deletion of the C-terminus of Knr4 resulted in increased resistance to cell wall-binding stressors (Congo Red and Calcofluor White), but not to the other chemical and physical stressors tested. In addition to their influence on stress resistance, the necessity of the N-terminus and the negative influence of the C-terminus of Knr4 were demonstrated in the ability of Knr4 to interact with one of its partner proteins Slt2, the MAPK of the CWI pathway. These results led to the hypothesis that the interaction of the disordered domains of Knr4 with partner proteins such as Slt2 is necessary for the function of Knr4 in stress resistance. NMR titration experiments with another known partner protein, Tys1, have suggested a low binding affinity between Knr4 and Tys1 and indicated some potential interaction regions in the N-terminal domain and loop of Knr4. We suggest that the interaction regions identified could also be involved in the Knr4-Slt2 interaction. It is even possible that these regions in the disordered domains of the Knr4 hub are also involved in interaction with other of its partner proteins. Upon induction of the CWI pathway, Slt2 is phosphorylated and enters the nucleus to activate gene transcription. We have shown that simultaneous deletion of the N-terminus and loop of Knr4 increases both total Slt2 levels and Slt2 phosphorylation, a result also seen for the knr4Δ strain. This suggests a potential inhibitory role for Knr4 on the presence of phosphorylated Slt2 which is an indicator of CWI pathway activation. In conclusion, this thesis has identified the disordered domains of the Knr4 hub protein as modulators of protein function in stress resistance to multiple stressors as well as in the interaction with one of its key partner proteins, the Slt2 MAPK. Some of these stress factors cause an increase in Slt2 phosphorylation and hence CWI signalling, a phenotype also found in mutants deleted for the N-terminus and loop of Knr4. This leads us to hypothesise that the Knr4 IDP could act as a potential (direct or indirect) regulator for the downregulation of the CWI pathway with an essential role for the disordered domains of the protein. Based on the hub nature of Knr4, interaction with other partner proteins could be regulated by the same disordered domains, suggesting that these Knr4 domains could be involved in different functions of the protein.
    Numéro national de thèse
    2024TLSES031
    Date de publication
    2024-06-04T12:48:43

Citation bibliographique

Donker, Helena Ignatia Maria (2024), Les trois domaines désordonnés de la protéine Knr4 et leur rôle dans l'hypersensibilité au stress et les interactions protéine-protéine chez la levure Saccharomyces cerevisiae [Thèse de doctorat]