Elucider le dialogue entre les mécanismes de régulations des complexes du protéasome via la spectrométrie de masse structurale
- Sanchez Dafun, Angelique (2024)
Thèse de doctorat
- Type de document
- Thèse de doctorat
- Diffusion
- Accès libre
- Titre
- Elucider le dialogue entre les mécanismes de régulations des complexes du protéasome via la spectrométrie de masse structurale
- Auteur
- Sanchez Dafun, Angelique
- Date de soutenance
- 2024-02-22
- École doctorale
- Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
- Structure de recherche
- Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089
- Discipline
- Biologie structurale et fonctionnelle
- Sujet
- Sciences du vivant
- Résumé en français
- Le protéasome 20S est un complexe multimérique composé de quatre anneaux heptamériques (αββα), responsable de la majorité de la dégradation des protéines cellulaires et d'autres fonctions, y compris la protéostasie, l'inflammation, la réponse immunologique, l'apoptose. Son activité accrue ou diminuée a été impliquée dans la pathogenèse de nombreuses maladies humaines, ce qui en fait une cible thérapeutique prometteuse. Trois inhibiteurs sont déjà utilisés pour le traitement de myélomes, et cette avancée majeure s'étend actuellement à d'autres pathologies en cherchant des médicaments toujours plus spécifiques. Des travaux importants ont été consacrés à l'analyse de la structure et de la fonction du protéasome. Cependant, en raison de sa complexité et de son hétérogénéité, l'un des défis est de déchiffrer sa dynamique. Ce projet de doctorat vise ainsi à étudier l'interaction entre les différents niveaux de régulation du protéasome (composition des sous-unités, liasion avec des activateurs et modifications post-translationnelles ou MPTs), en utilisant des approches de MS structurale, et à rechercher de nouveaux inhibiteurs spécifiques à chaque paire de 20S-activateur. Nous avons établi une stratégie expérimentale efficace pour la caractérisation moléculaire et la quantification relative des protéasomes 20S grâce à la top-down MS, dans le contexte de maladies inflammatoires. Ceci a permis de mettre en évidence des MPTs, l'induction d'immunoprotéasome, ou les variations de composition et d'assemblage des complexes de protéasome en lien avec des variants génétiques chez des patients souffrant de syndromes auto-inflammatoires associés au protéasome. Cette approche, combinée aux données de bottom-up MS, permet d'étudier les conséquences moléculaires et fonctionnelles de changements de protéoformes de sous-unité 20S et/ou les variations d'interactions préférentielles entre les sous-types de protéasome et les régulateurs, sans avoir recours à la biologie moléculaire. L'approche développée dans cette thèse offre une caractérisation approfondie des différentes protéoformes 20S en un temps d'analyse raisonnable et peut être directement appliquée à des échantillons cliniques ou de patients, peu abondants et/ou rares. Nous avons ensuite étudié l'effet des activateurs PA28 et d'inhibiteurs connus sur la structure et la dynamique du protéasome 20S. Les résultats ont confirmé que PA28β a une boucle d'activation moins flexible que PA28α et que l'incorporation de PA28β dans l'anneau heptamérique de PA28α induit une rigidité supplémentaire. PA28αβ a une meilleure affinité pour n'importe quel 20S par rapport à PA28γ, mais active plus l'i20S que le c20S, en accord avec le rôle du protéasome PA28αβ-i20S lors de l'inflammation. En ce qui concerne l'inhibition, la liaison avec le Bortezomib entraîne une plus grande rigidité de l'anneau β de l'i20S par rapport au c20S, alors que l'interaction entre ONX-0914 et l'i20S apporte une certaine flexibilité. Les résultats ont non seulement confirmé les sites de liaison et les préférences des inhibiteurs, mais également identifié des changements de conformation dans les sites β non catalytiques voisins, à la fois au niveau des interfaces des anneaux β/β et des anneaux α/β, pouvant entraîner des variations allostériques jusqu'à l'anneau α. Enfin, nous avons criblé des inhibiteurs uniques à certaines paires de complexes 20S-PA28. Nous avons identifié neuf composés potentiellement spécifiques de l'i20S-PA28αβ. Des expériences additionnelles et des modifications structurales sont nécessaires pour continuer à améliorer ces composés. Dans l'ensemble, nos résultats montrent la complexité du protéasome et de sa régulation, qui sont associées aux sous-unités catalytiques qu'il comporte et de l'activateur avec lequel il est lié. Ceci souligne l'importance de mieux comprendre la régulation structurale du protéasome dans certaines maladies, afin de concevoir des médicaments spécifiques pour des traitements plus ciblés.
- Résumé en anglais
- The 20S proteasome is a multimeric complex of four stacked heptameric rings in αββα assembly that is in charge of the majority of protein degradation in the cells. Scientists have long recognized the importance of the proteasome in a variety of cell functions, including proteostasis, inflammation, immunological response, apoptosis, and the pathogenesis of many human diseases. Its increased or decreased activity has been linked to a number of diseases, making it a promising therapeutic target. The development over the years resulted in the approval of three inhibitors for myeloma treatment, and this advancement substantially impacted proteasome research, which is currently expanding to other disorders and aiming at more specific drugs. To fully understand its role, significant work has been put into analyzing its structure and function. However, due to its complexity and heterogeneity, one of the current challenges is deciphering its dynamics. To contribute to this effort, the goal of this PhD project was to investigate the interplay of structure-centered proteasome regulation (subunit composition variations, partnering with activators, and post-translational modifications or PTMs) using structural mass spectrometry (MS) approaches, and to seek novel 20S subtype-activator-specific proteasome inhibitors. We established a more efficient workflow for the proteoform characterization and relative quantification of 20S proteasome related to inflammation with top-down MS, revealing PTMs, induction of immunoproteasomes, genetic variations in patients associated with Proteasome-Associated Autoinflammatory Syndromes and their effect on 20S assembly. This, in conjunction with bottom-up MS data, is capable of studying the molecular and functional consequences of 20S subunit proteoforms and/or preferential interactions between proteasome subtypes and regulators favored in response to proteasome-related diseases, and without the need to do additional molecular biology constructions. This workflow of complementary approaches offers a thorough characterization of the different 20S proteoforms at a reasonably efficient analysis time and can be directly applied to valuable and low abundant clinical or patient samples. We then investigated the effect of PA28 activators to 20S structure and dynamics, and further characterized the molecular mechanisms of proteasome inhibition. The results confirmed that PA28β has a less flexible activation loop than PA28α and that the incorporation of PA28β in the PA28α heptameric ring induces additional rigidity to the heptamer. PA28αβ has a better affinity for any 20S compared to PA28γ, but activates more the i20S than the c20S, in line with the role of PA28αβ-i20S during inflammation-related conditions. In terms of inhibition, Bortezomib binding resulted in higher rigidity/protection of i20S' β-ring compared to c20S, while ONX-0914 binding to i20S brought some added flexibility. The results not only confirmed the inhibitors' binding sites and preferences but also identified conformational changes in neighboring non-catalytic β-sites through conformational changes in both the β-/β-ring and α-/β-ring interfaces that may also bring allosteric changes in the α-ring. Lastly, we tried to find inhibitors unique to certain 20S-PA28 complexes by ligand screening. We found nine compounds that are potentially specific for i20S-PA28αβ, with IC50 in the low µM range. Further confirmation and structural investigation are needed to further develop these compounds. Altogether, our findings show the intricacy of the proteasome and its regulation, which varies mostly based on which catalytic subunits it possesses and which activator it is associated with. This highlights the importance of better understanding the structural regulation of the proteasome in certain disease conditions, in order to design specific drugs for more targeted treatments.
- Numéro national de thèse
- 2024TLSES012
- Date de publication
- 2024-06-13T10:31:12
Citation bibliographique
Sanchez Dafun, Angelique (2024), Elucider le dialogue entre les mécanismes de régulations des complexes du protéasome via la spectrométrie de masse structurale [Thèse de doctorat]